Identificación de grupos sanguíneos
Introducción
La tipificación de grupos sanguíneos, es una prueba que determina el tipo de sangre de una persona al analizar la compatibilidad donante-receptor con antígenos y anticuerpos de los grupos sanguíneos. Es esencial si se necesita de una transfusión de sangre o si se planea ser donante, además, permite la identificación y confirmación de mujeres Rh-, y con ello la mejora del diseño de las consultas preconcepcionales y prenatales.
Si bien ABO y Rh son los más importantes, se han identificado hasta el cierre de esta revisión un total de 43 sistemas de grupos sanguíneos que contienen 345 antígenos para glóbulos rojos humanos (1). Esto ocasiona que otras pruebas sean necesarias en algunos casos, como una prueba de detección de anticuerpos contra glóbulos rojos de sistemas poco comúnes, acompañada de una prueba cruzada para determinar los componentes sanguíneos que pueden administrarse de forma segura.
Antecedentes
El sistema ABO fue descubierto por primera vez en 1900 por Karl Landsteiner al realizar pruebas cruzadas de glóbulos rojos con sueros de diferentes individuos. Posteriormente fue clasificado según los cinco antígenos de glicoproteína (A, B, AB, A1 y H) que se expresan en la superficie de los glóbulos rojos (Figura 1). (1)
Figura 1. Grupo ABO.
Genética del sistema ABO
El gen H, ubicado en el cromosoma 19, codifica para la producción de la enzima transferasa H, que une una molécula de L-fucosa a la galactosa terminal (Gal) de un precursor común unido a los lípidos o proteínas de membrana del eritrocito, dando origen al antígeno H, el cual constituye el paso inicial en la formación de los antígenos de los grupos sanguíneos ABO.
Para que se produzca antígeno H, debe existir al menos una copia funcional del gen H (H/H o H/h); si ambas copias del gen son inactivas (h/h) se produce el fenotipo Bombay. Es por ello que el suero de los pacientes con eritrocitos Bombai presenta anticuerpos contra el antígeno H, que reaccionan con células A, B, AB y O. Por lo tanto, las personas con el fenotipo Bombay deben ser transfundidas sólo con eritrocitos de fenotipo Bombay. (2)
El gen ABO, ubicado en el cromosoma 9, posee tres alelos: A, B y O; que varían de acuerdo a las sustituciones de nucleótidos, las cuales determinan las especificidades de las enzimas para las cuales codifican. (2) Los alelos que codifican para el grupo ABO se expresan en 10 posibles combinaciones o genotipos (Tabla X). Los alelos A1 y A2 son codominantes en relación al B y presentan dominancia completa sobre el alelo recesivo O. El alelo A1 es dominante sobre el A2.
| Genotipo | Fenotipo |
|---|---|
| A1A1 | A1 |
| A1A2 | A1 |
| A1O | A1 |
| A2A2 | A2 |
| A2O | A2 |
| BB | B |
| BO | B |
| A1B | A1B |
| A2B | A2B |
| OO | O |
Tabla 1. Diferentes combinaciones del gen ABO y Fenotipo expresado.
Sistema Rhesus (Rh)
El sistema Rh se descubrió en la década de 1940 y es uno de los sistemas de grupos sanguíneos más polimórficos y antigénicos. Ocupa el segundo lugar después del sistema ABO según importancia en la transfusión y es bien conocido como causa principal de la enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido.
El antígeno principal es el D, y los términos Rh positivo y Rh negativo se refieren a la presencia o ausencia del antígeno D. Otros antígenos Rh comunes son los antígenos C, c, E y e. Los pacientes no suelen ser tipificados para estos antígenos a menos que hayan desarrollado anticuerpos atípicos o deban someterse a transfusiones a largo plazo.
Dos genes RHD y RHCE ubicados en el brazo corto del cromosoma 1, codifican para las proteínas Rh: uno codifica el antígeno D y el otro codifica los antígenos CE en diversas combinaciones (ce, cE, Ce o CE). La mayoría de los fenotipos D negativo (Rh negativo) son el resultado de la deleción completa del gen RHD. (3)
El antígeno D es muy antigénico y antes del uso rutinario de la inmunoglobulina Rh, el anticuerpo anti-D era el único anticuerpo clínicamente significativo que se observaba con mayor frecuencia en las pruebas pretransfusionales.
Aproximadamente el 2% de los individuos de origen europeo, presentan cambios en el gen RHD. Estas modificaciones codifican cambios estructurales en el antígeno RhD, que suelen causar fenotipos RhD débil y RhD parcial.
La expresión débil del antígeno D se encuentra principalmente en personas con un único gen RHD que tiene una mutación que codifica para un cambio aminoacídico. Esto ocasiona que algunos glóbulos rojos con niveles extremadamente bajos de antígeno D no sean detectados por métodos de tipificación rutinarios.
Los glóbulos rojos con antígeno D parcial son el resultado de la herencia de genes híbridos en los que porciones de RHD se sustituyen por las porciones correspondientes de RHCE. Esto provoca la pérdida de algunos epítopos D. Aunque los glóbulos rojos se tipifican como D positivos, estos pacientes generan anticuerpos anti-D tras una transfusión o un embarazo.
Los antígenos C y c están codificados por formas alternativas del gen RHCE y son codominantes entre sí, con igual expresión en genotipos Cc. Los antígenos E y e son codominantes, y en todas las poblaciones e es más frecuente que E. (3)
Fundamentos generales de los test de determinación de grupos sanguíneos
La presencia de antígenos ABO/RhD en la superficie celular, está asociada a la ausencia de anticuerpos específicos para ese antígeno. En la tabla y se observan las diferentes combinaciones posibles de anticuerpos y antígenos presentes en un mismo paciente para los sistemas ABO/Rh.
| Grupo | Anti-A | Anti-B | Anti-AB | Anti-D |
|---|---|---|---|---|
| A+ | - | + | + | - |
| A- | - | + | + | + |
| B+ | + | - | + | - |
| B- | + | - | + | + |
| AB+ | - | - | - | - |
| AB- | - | - | - | + |
| O+ | + | + | + | - |
| O- | + | + | + | + |
Tabla y. Diferentes combinaciones de Antígenos y Anticuerpos expresados en los sistema ABO/Rh.
Los principios de identificación de los grupos sanguíneos en su mayoría se basan en reacciones antígeno-anticuerpo. Varios anticuerpos reaccionan con antígenos de superficie específicos provocando cierto grado de aglutinción. Este resultado se interpreta como positivo para el fenotipo del antígeno de superficie expresado (ej. A+).
Por otra parte, las pruebas cruzadas se basan en la reacción de antígenos de superficie presentes en los globulos rojos de posibles donantes con anticuerpos presentes en el plasma de un receptor. Si la prueba cruzada es positiva expresa incompatibilidad donante-receptor. Sistemas diferentes al ABO/Rh pueden provocar una prueba cruzada positiva, de ahí deriva su importancia clínica para evitar reacciones posttransfusionales.
Métodos de análisis de grupos sanguíneos
Test de aglutinación en placa
El test de aglutinación en placa es un método simple y rápido (de 5 a 10 minutos) para determinar los grupos sanguíneos empleando pequeñas cantidades de reactivos. Esta técnica a pesar de su rapidez, cuenta con varias desventajas: los antígenos raros o débilmente expresados no pueden detectarse fácilmente, mientras que los títulos bajos de anticuerpos anti-A o anti-B a menudo conducen a resultados falsos negativos. Es por ello que se utiliza de forma rutinaria solo en casos de emergencia.
Test de aglutinación en tubo
En comparación con el test de aglutinación en placa, el test de aglutinación en tubo es más sensible y fiable, por lo tanto, puede usarse convenientemente para transfusiones de sangre. Para realizar la prueba, la mezcla de glóbulos rojos y anticuerpos se centrifuga y el resultado se interpreta fácilmente mediante un examen visual. Si el sedimento de glóbulos rojos en el tubo de ensayo no se altera después de centrifugar durante unos minutos y agitar suavemente, se considera una aglutinación completa (Imagen 1).
Imagen 1. Test de aglutinación en tubo, paciente O+. Tomado de Wikimedia.
En caso de falta de aglutinación evidente, se deposita una pequeña cantidad de suspensión de glóbulos rojos sobre un portaobjetos de vidrio y se observa el grado de aglutinación bajo el microscopio (Figura 2).
Figura 2. Representación esquemática de aglutinación de eritrocitos en sangre AB. Creado con Biorender.
Test de aglutinación en microplacas
La tecnología de microplacas utiliza plataformas automatizadas para detectar anticuerpos séricos y antígenos de superficie presentes en glóbulos rojos. Los reactivos y globulos rojos se centrifugan y se incuban en microplacas, y el tipo de sangre ABO/RhD se interpreta a través de un sistema automatizado. Tiene las ventajas de velocidad, bajo consumo de reactivos y análisis de alto rendimiento.
El método de aglutinación en microplacasplaca con forma de U (Figura 3) implica la adición de plasma y glóbulos rojos, centrifugación, incubación con agitación constante y observación e interpretación finales. Es uno de los más empleados al poder detectar múltiples grupos sanguíneos de varios pacientes al mismo tiempo. La aparición de coágulos de glóbulos rojos o arena fina en los microporos en forma de U indican aglutinación.
Figura 3. Método de aglutinación en microplacas con forma de U. Creado con Biorender.
Test de aglutinación en microcolumna de gel
La tecnología de aglutinación en microcolumna de gel fue introducida por Lapierre et al. (4) en 1990. La versión automatizada es el método estándar para la tipificación de grupos sanguíneos en laboratorios clínicos y bancos de sangre. La microcolumna está hecha de pequeños microtubos que contienen matriz de gel para atrapar aglutinados.
El suero sanguíneo o las células se mezclan con reactivos anti-A, anti-B y anti-D en microtubos bajo incubación y centrifugación controladas. Las partículas de gel atrapan los aglutinados, mientras que las células sanguíneas no aglutinadas pueden pasar a través de la columna (Imagen 2). (5)
El tiempo de análisis se puede reducir utilizando partículas de vidrio en lugar de gel, ya que de esta manera se logran velocidades de centrifugado más rápidas. Algunas ventajas de este método es que se emplean pequeñas cantidades de reactivos y tiene alta sensibilidad, precisión y reproducibilidad, lo que ayuda a reducir los errores de identificación causados por factores humanos.
Imagen 2. Aglutinación en microcolumnas de gel, paciente O+. Tomado de Wikimedia.
Test de aglutinación dual en papel (ABO/Rh)
Los dispositivos de diagnóstico en papel son cada vez más populares debido a su capacidad para realizar pruebas de diagnóstico rápidas y de bajo coste en un entorno fuera del laboratorio y de gran comodidad para el paciente, un ejemplo de ello es la consulta del médico de familia. (6)
Una de las técnicas más notorias de esta tecnología fue desarrollado por Noiphung et al. (7), quienes adoptaron el enfoque de aglutinación de glóbulos rojos utilizando anticuerpos inmovilizados en una tira de papel. Para ello desarrollaron un ensayo basado en papel que realizaba simultáneamente la determinación directa e inversa de los grupos ABO y Rhesus.
Su diseño consistía en tres canales cuadriculados para la agrupación directa, dos de los cuales se utilizaban también para la agrupación inversa (Imagen 3). El dispositivo se fabricó utilizando papel de cromatografía y membrana de separación de plasma con métodos combinados de impresión e inmersión en cera.
Imagen 3. Aglutinación en papel. Tomado de Ebrahimi Fana, S et al. Biomed Microdevices. 2021.
En la agrupación directa (Forward side), la muestra de sangre diluida en una proporción de 1/2 se aplicaba en el lado frontal del dispositivo (papel de cromatografía) y fluía hacia los tres canales impregnados previamente con anticuerpos anti-A, anti-B y anti-D.
En la agrupación inversa (Reverse side), la sangre sin diluir se aplicó en el reverso del dispositivo (membrana de separación del plasma) y el plasma fluyó hacia los dos canales impregnados con glóbulos rojos de tipo A y glóbulos rojos de tipo B.
Este ensayo económico y robusto resultó ser útil para entornos con tiempo y recursos limitados.
Test de aglutinación en papel con colorante
Este método desarrollado por Zhang, H. et al. (8) emplea el papel línter como matriz y el colorante verde de bromocresol. Dependiendo de la presencia o ausencia de aglutinación, este colorante experimenta un cambio de color específico en la zona de reacción.
La tira de papel puede detectar con precisión los grupos sanguíneos ABO/Rh en 30 segundos y determinar 16 grupos sanguíneos raros en 3 min. Además, cuenta con una plataforma de discriminación rápida de errores y un algoritmo de corrección del color. Este test es de elección en casos de emergencia. (Imagen 4)
Imagen 4. Aglutinación en papel con colorante. Tomado de Zhang, H. et al. Science Translational Medicine. (8)
Dispositivos microfluídicos
Estos dispositivos dependen de la microfluidización digital, que manipula gotitas discretas a escala nanométrica o microscópica en una guía de electrodos abierta aumentando el potencial eléctrico. (9)
El test consta de 2 placas, una inferior que contiene un conjunto de electrodos de actuación utilizados para manipular gotas que contienen reactivos de ensayo o muestras de sangre, y una placa superior que actúa como contraelectrodo.
Los ensayos de hemaglutinación se realizan dosificando gotitas de sangre total en la matriz de electrodos, donde se mezclan con gotas de anticuerpos aglutinantes (tipificación sanguínea), plasma del donante (compatibilidad) o agentes de químicos (hematocrito).
Para la determinación del grupo sanguíneo, los anticuerpos antiA, anti-B, anti-AB o anti-D se mezclan cada uno con gotitas separadas de sangre total. (Imagen 5)
Imagen 5. Aglutinación en dispositivos microfluídicos. Tomado de Sklavounos AA et al. Clin Chem. (9)
Las ventajas de esta técnica es que las muestras pueden ser recogidas, procesadas y cuantificadas mediante un sistema automatizado, empleando instrumentos portátiles sencillos que pueden funcionar en entornos remotos y difíciles con acceso limitado a laboratorios centralizados. Otra de las ventajas es que puede detectarse la compatibilidad con el donante realizando un test a la par en el mismo dispositivo.
Sensores basados en guías de ondas
Un sensor basado en guía de ondas puede detectar partículas y moléculas en el chip sensor utilizando la potenciación del campo eléctrico con modulaciones de guía de ondas.
Imagen 5. Principio de funcionamiento del sensor basado en guía de ondas. Tomado de Ashiba, H. et al. Sensing and Bio-Sensing Research. (10)
Este método de detección de hemaglutinación proporciona una forma sencilla de tipificación sanguínea basada en sensores ópticos utilizando un instrumento portátil. El método es tan sencillo como el test de aglutinación en placa, con una sensibilidad potencialmente superior.
Tecnología de eritrocitos magnetizados
Es una tecnología automatizada para la determinación de los sistemas ABO/Rh y de anticuerpos sobre la base de la magnetización de los glóbulos rojos con de partículas magnéticas.
Durante el proceso de análisis, estas partículas se fijan en la superficie de los glóbulos rojos por adsorción o por unión a la glicoproteína A (GPA). La unión por adsorción emplea partículas de hierro con carga positiva, las cuales se unen a las moléculas con carga negativa presentes en la superficie del glóbulo rojo. La unión a la GPA está mediada por un anticuerpo específico Anti-GPA asociado a una partícula de hierro (Imagen 6). (11)
Imagen 6. Tecnología de eritrocitos magnetizados por unión a GPA. Tomado de DIAGAST E.M.® Technology
Cuando se exponen a un campo magnético en la microplaca, los glóbulos rojos migran al fondo de cada pocillo. De este modo se intensifica la reacción antígeno-anticuerpo (Figura 4). Este efecto elimina el paso de centrifugación durante el proceso analítico.
Figura 4. Principios de la Tecnología de eritrocitos magnetizados. Tomado de Bouix, O. et al. Transfusion. (12)
Tecnología de resonancia de plasmones
La resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en inglés) es una técnica sensible para rastrear interacciones moleculares en tiempo real. En general, los anticuerpos IgM o IgG específicos para antígenos del sistema ABO en la superficie del plasmón, pueden utilizarse para identificar grupos sanguíneos. La intensidad de la aglutinación depende de la adhesión de los glóbulos rojos y de su capacidad de disociación (Figura 5).
Figura 5. Representación de eritrocitos inmobilizados con la tecnología SPR. Tomado de Wanida Tangkawsakul et al. International Journal of Analytical Chemistry. (13)
SPR permite determinar el grupo sanguíneo ABO/Rh en 12 minutos. El chip sensor puede cuantificar la presencia de antígenos de superficie de los grupos sanguíneos, lo que podría favorecer la detección de variantes más débiles. Sin embargo, la SPR requiere equipos y consumibles caros y puede no ser práctica para las pruebas rutinarias de grupos sanguíneos. (13)
Conclusiones
Continuamente surgen nuevas tecnologías para el análisis de los grupos sanguíneos capaces de detectar con precisión sus diferentes variantes. Sin embargo, algunos test requieren de mucho tiempo para su realización y sus costes son elevados.
Los métodos serológicos siguen siendo los de mayor uso rutinario para la tipificación ABO y Rh. Estos métodos de conjunto con las tecnologías de tipificación en desarrollo garantizan una transfusión segura.
Referencias Bibliográficas
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